單克隆抗體 (mAb) 自幾十年前問世以來，已經(jīng)重塑了生物制藥和靶向治療市場，其開發(fā)策略的不斷改進產(chǎn)生了一個充滿希望的未來。簡單來說，單克隆抗體是具有高特異性的免疫球蛋白，具有高特異性，選擇性地靶向單個抗原表位，從而允許對特定疾病進行靶向治療，大大減少副作用并提高療效。治療性單克隆抗體的工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)歷了顯著的增長擴張，且隨著越來越多的產(chǎn)品實現(xiàn)商業(yè)化，很多此前認為的問題和挑戰(zhàn)已經(jīng)得到解決，所以當前的主要目標已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿绾芜M一步強化和優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以降低成本，提高經(jīng)濟效益。

生物工藝優(yōu)化由于其復(fù)雜性以及潛在的高成本性質(zhì)，可能是一項艱巨的任務(wù)，由于這些原因，許多生物制藥公司會避免在這方面花費太多時間或金錢。盡管理論上有更好的替代方案和優(yōu)化機會，但低效的批次工藝仍然主導(dǎo)著市場?？紤]到在生產(chǎn)過程的每個階段必須考慮的眾多工藝參數(shù)，這在某種程度上是可以理解的。

生產(chǎn)治療性單克隆抗體的哺乳動物細胞在懸浮培養(yǎng)中生長，需在保持90%以上活力的同時，實現(xiàn)非常高的細胞密度。為了實現(xiàn)這一目標，必須構(gòu)建一種穩(wěn)健且高產(chǎn)的單克隆抗體細胞系。為此，首先使用一個具有現(xiàn)有選擇系統(tǒng)的工業(yè)哺乳動物細胞系以專為特異性單抗設(shè)計的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。然后將轉(zhuǎn)染的細胞在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在數(shù)周內(nèi)擴增。在此過程中，鑒定并選擇產(chǎn)量最高的無性系進行進一步擴增。一旦理想的克隆經(jīng)過數(shù)周的反復(fù)選擇和擴增，小體積的細胞被放置在低溫保存管中，形成一個主細胞庫。單個管從這個主細胞庫中取出，用于創(chuàng)建工作細胞庫。低溫保存的細胞通常首先接種在小體積搖瓶中進行批次培養(yǎng)。一旦在搖瓶中達到較高的細胞密度，細胞傳代到一個小的種子生物反應(yīng)器中并再次培養(yǎng)到高密度。這一過程在越來越大的種子生物反應(yīng)器中迭代重復(fù)，直到最終進入最后的生產(chǎn)生物反應(yīng)器，其體積通常為數(shù)百甚至數(shù)千升。當最終培養(yǎng)物低于期望的活力閾值后，通過離心和過濾去除細胞和固體碎片，并保存回收的料液用于下游處理，即mAb純化。

該行業(yè)已經(jīng)實施了許多改進措施，以提高細胞密度和活力，以及單克隆抗體滴度和質(zhì)量。例如，過渡到無血清培養(yǎng)基，以通過消除培養(yǎng)基組成的可變性，從而提高培養(yǎng)的可重復(fù)性，以及開發(fā)細胞過程的預(yù)測數(shù)學(xué)建模，以節(jié)省優(yōu)化培養(yǎng)條件所需的大量時間和資源。本文將簡要介紹在上游工藝中，可能實現(xiàn)強化的一些路徑。

一次性生物反應(yīng)器以及提高工藝監(jiān)測和控制

生物反應(yīng)器的使用為產(chǎn)單抗哺乳動物細胞培養(yǎng)提供了諸多優(yōu)勢，但是各種生物反應(yīng)器的尺寸、結(jié)構(gòu)和功能非常不同。在最近的發(fā)展中，許多生物反應(yīng)器制造公司正在將重點轉(zhuǎn)向一次性生物反應(yīng)器，而不是可重復(fù)使用的不銹鋼生物反應(yīng)器。在大規(guī)模工業(yè)環(huán)境中，一次性生物反應(yīng)器很有吸引力，因為它們大大降低了污染的風(fēng)險。對于不銹鋼生物反應(yīng)器，必須在兩次培養(yǎng)之間進行大量的清潔和消毒工作，以避免污染。一次性生物反應(yīng)器到貨時已預(yù)滅菌，并可在使用后進行拋棄處理，減少了清潔和消毒所需的時間和資源，并消除了下一次培養(yǎng)中污染的風(fēng)險。在生物反應(yīng)器的管路和端口中使用一次性無菌連接器也是在接種、取樣和培養(yǎng)補液期間保持無菌性的必要內(nèi)容。當然，另一方面，限于一次性生物反應(yīng)器的體積限制，對于超大型生產(chǎn)規(guī)模，不銹鋼生物反應(yīng)器仍是唯一的選擇。

外圍技術(shù)用于實時在線監(jiān)測和控制重要的過程參數(shù)，如pH值、氣體級聯(lián)強度、溶解的O2、溫度和攪拌速度，隨著用戶友好和行業(yè)標準軟件的開發(fā)，保持穩(wěn)健且自動化的過程控制變得越來越容易。生物反應(yīng)器設(shè)計以及過程控制和監(jiān)測技術(shù)的不斷改進將允許單克隆抗體產(chǎn)品的強化及可重復(fù)性生產(chǎn)。

多寧DuoBioX? Pro一次性生物反應(yīng)器采用底部攪拌式罐體設(shè)計，可實現(xiàn)從50 L-2,000 L規(guī)模生物工藝的連續(xù)放大，結(jié)合多寧完全自主研發(fā)制造的3D一次性細胞培養(yǎng)袋，具有良好的生物相容性優(yōu)點，其靈活的管路設(shè)計，滿足各類復(fù)雜的上游工藝過程；其獨特的攪拌通氣一體組合設(shè)計，不僅能降低剪切，同時又保證了優(yōu)異的傳質(zhì)和混勻性能，放大前后工藝一致性好，可廣泛應(yīng)用于生物制藥工藝研發(fā)到GMP生產(chǎn)等各個階段。

培養(yǎng)模式：補液分批、灌流 vs. 批次培養(yǎng)

在工業(yè)環(huán)境中，批次培養(yǎng)由于其簡單性和悠久的成功歷史，無疑是最廣泛用于單克隆抗體生產(chǎn)的方法。然而，補液分批培養(yǎng)原則上可通過提供關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)以防止耗竭來改進培養(yǎng)，但這增加了培養(yǎng)體積。連續(xù)培養(yǎng)采用類似的策略，但去除等量的添加體積，以避免增加工作體積和稀釋培養(yǎng)，然而，這導(dǎo)致在補液時總活細胞數(shù)減少。灌流培養(yǎng)技術(shù)在此基礎(chǔ)上進行了改進，過濾掉營養(yǎng)耗竭的培養(yǎng)基和部分細胞碎片，同時截留所有細胞。

這些技術(shù)的實施在理論上是非常明智的，但實際納入工業(yè)生產(chǎn)過程需要大量的開發(fā)以及優(yōu)化時間和成本。然而，補液分批和灌流技術(shù)的長期可持續(xù)性和前景已經(jīng)促使一些能夠承擔高額前期成本和技術(shù)轉(zhuǎn)移的大型生物技術(shù)公司將其更多的工藝從傳統(tǒng)方法中轉(zhuǎn)移出來。

組學(xué)表征

細胞系的全面表征是優(yōu)化培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。通過優(yōu)化工藝參數(shù)，更好地適應(yīng)它們的生長和生產(chǎn)力需求，對其組成和行為特征進行更深入的了解是必要的第一步。代謝組學(xué)廣泛地描述了細胞中作為底物、中間體或代謝過程產(chǎn)物的小分子的大規(guī)模定量，這些小分子共同構(gòu)成了代謝組學(xué)。液相色譜-質(zhì)譜 (LC-MS) 是代謝組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的方法，其它技術(shù)包括核磁共振 (NMR) 和氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 等。

蛋白質(zhì)組學(xué)類似地描述了由細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定和定量。由于蛋白質(zhì)的表達有多種目的，蛋白質(zhì)組學(xué)可以用來表征功能和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組。凝膠電泳和SDS-PAGE是常用的蛋白質(zhì)表達譜分析方法，質(zhì)譜法與色譜法串聯(lián)使用用于蛋白質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)表征。

基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)需要通過PCR、DNA微陣列、下一代測序和RNA測序等手段繪制和表征細胞的DNA和轉(zhuǎn)錄RNA，這有助于進一步了解特定細胞系在關(guān)鍵生長和代謝階段的基因組和功能轉(zhuǎn)錄組。脂質(zhì)組學(xué)描述了通過質(zhì)譜或核磁共振對特定脂質(zhì)的色譜分離和隨后的鑒定和定量。像蛋白質(zhì)一樣，脂質(zhì)不僅對結(jié)構(gòu)組成(即磷脂膜)有重要貢獻，而且對細胞代謝也有重要貢獻。所有這些“組學(xué)”技術(shù)，可用于在成功和失敗培養(yǎng)的不同階段開發(fā)細胞特征的綜合信息。

培養(yǎng)基設(shè)計和補液策略優(yōu)化

培養(yǎng)基的作用是為培養(yǎng)細胞提供關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)和大分子的唯一外源支持，因此其組成對mAb生產(chǎn)的優(yōu)化和成功至關(guān)重要。維生素、氨基酸、緩沖鹽、脂質(zhì)和微量金屬的相對濃度會對培養(yǎng)細胞的生產(chǎn)力和活力產(chǎn)生重大影響，許多細胞系對任何成分的偏差都非常敏感。研究發(fā)現(xiàn)，用不含血清的化學(xué)限定培養(yǎng)基替代含血清的培養(yǎng)基，通過消除血清批次間成分差異的重要來源，極大地提高了培養(yǎng)的可重復(fù)性，這對于維持穩(wěn)健的生物工藝尤為重要。然而，考慮到?jīng)]有兩個細胞系具有相同的營養(yǎng)需求，優(yōu)化單克隆抗體生產(chǎn)的一個重要步驟是確定培養(yǎng)基組成，以滿足任何給定工業(yè)相關(guān)細胞系的特定生長和生產(chǎn)力要求。

這種優(yōu)化可以通過對培養(yǎng)基成分和細胞代謝物的動態(tài)消耗和生產(chǎn)的實驗觀察以及前文描述的“組學(xué)”數(shù)據(jù)相結(jié)合來實現(xiàn)。對不同條件下培養(yǎng)代謝行為的顯著變化的識別，可以闡明關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)的過?；蛉狈?，這兩種情況都可能導(dǎo)致生長抑制、生產(chǎn)力低下以及有毒代謝物 (如乳酸和氨) 的累積。研究表明，僅通過優(yōu)化培養(yǎng)基就能精確滿足細胞維持和增殖、單克隆抗體產(chǎn)生和能量代謝的營養(yǎng)需求，從而顯著提高單克隆抗體生產(chǎn)細胞系的單位體積生產(chǎn)力。

多寧細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品研發(fā)團隊根據(jù)mAb的生產(chǎn)工藝特點，重點研究培養(yǎng)基配方機理、CHO細胞代謝機制及培養(yǎng)基穩(wěn)定性，并通過CHO細胞代謝模型分析合理的實驗設(shè)計，成功設(shè)計開發(fā)了Media C系列和DN feed系列培養(yǎng)基產(chǎn)品。該套產(chǎn)品可滿足不同類型CHO細胞（CHOK1、CHOS、DG44等）的生長、代謝和表達需求。Media C系列和DN feed系列結(jié)合了高性能和高品質(zhì)的兩大優(yōu)點，其卓越性已在多個臨床后期和商業(yè)化項目證實。

多寧MediaC系列無血清培養(yǎng)基即DN feed系列補液培養(yǎng)基

實驗設(shè)計方法

細胞內(nèi)的生化過程已經(jīng)被廣泛繪制，以更好地了解它們的需求和行為，研究人員也能夠應(yīng)用數(shù)學(xué)方程來描述它們的動態(tài)關(guān)系。這是生物工藝開發(fā)和優(yōu)化中最重要和發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。簡而言之，DOE是一種優(yōu)化策略，它使用應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)來生成一系列不同的實驗條件，從而以高度可控的方式對多個工藝參數(shù)進行綜合測試。系統(tǒng)地評估每個參數(shù)及其對工藝反應(yīng)的影響，如單克隆抗體產(chǎn)量或細胞密度，以最大限度地提高生產(chǎn)力，并使可變性最小化。一種稱為析因設(shè)計的技術(shù)用于確定在實驗運行期間要改變哪些因素以及將測試多少個水平，例如低、中、高。每個實驗或運行，涉及到一個獨特的組合因素水平的應(yīng)用，稱為處理。例如在一項3^3因子設(shè)計中，三個因素分別在三個不同的水平上進行測試，雖然該設(shè)計有27種可能的治療方法，但研究只進行了10次試驗，這是一個分數(shù)因子設(shè)計的例子，其中從全因子設(shè)計中選擇處理的子集，以強調(diào)最可能具有最大影響的變量的重要性，同時最小化時間和成本。篩選實驗可以用來確定重要因素，以重點進行分數(shù)因子設(shè)計。

多寧生物DuoBioX? Explore是一款設(shè)計領(lǐng)先、性能優(yōu)異、功能齊全并且易于操作的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器系統(tǒng)，適用于生物制藥行業(yè)細胞培養(yǎng)工藝的開發(fā)研究。用戶只需要一臺電腦就能同時控制1至8臺玻璃罐相互獨立或平行組合運行，這將極大加速工藝開發(fā)進程。DuoBioX? Explore多聯(lián)平行反應(yīng)器內(nèi)嵌DoE功能，提供多種DoE方法選擇，功能涵蓋篩選和優(yōu)化，試驗設(shè)計一鍵分配至衛(wèi)星罐，可實現(xiàn)無縫對接，結(jié)果分析可視化圖形輸出，確定最優(yōu)范圍，是上游工藝條件優(yōu)化和表征研究的最佳搭檔。

DuoBioX? Explore 多聯(lián)平行生物反應(yīng)器系統(tǒng)

*詳細產(chǎn)品信息，請聯(lián)系marketing@duoningbio.com

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