慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，粒徑為80-120nm，由單鏈RNA序列組成，其轉(zhuǎn)錄成DNA并可整合到宿主基因組中，導致持續(xù)感染。大多數(shù)慢病毒載體源于HIV-1，并保留整合至感染細胞基因組的能力。LV由于能夠更有效地轉(zhuǎn)導非增殖或緩慢增殖的細胞，在臨床應用中非常流行。近來，多個使用臨床試驗使用第三代自滅活LV將基因?qū)朐煅杉毎?，以治療原發(fā)性免疫缺陷或血紅蛋白病[2]。LV最常見的應用是通過嵌合抗原受體（CAR）或克隆的T細胞受體遞送引入基因，以產(chǎn)生對抗腫瘤的免疫。

對于慢病毒的上游生產(chǎn)，盡管已經(jīng)有研究證明制備穩(wěn)定的慢病毒載體包裝/生產(chǎn)細胞系是可行的，其有潛力提高批次間的一致性，保證供應并降低成本[6]，因其可簡化LV生產(chǎn)的操作和供應鏈，但往往需要較長的細胞系開發(fā)構(gòu)建時間，所以基于HEK293T細胞以質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染的策略仍是慢病毒載體大規(guī)模生產(chǎn)的主要選擇。對于細胞培養(yǎng)，在開發(fā)階段，鑒于僅需要較小的批次體積，以及HEK293T細胞的貼壁特性和耗材的簡單可獲得性，以貼壁培養(yǎng)為主導。但隨著規(guī)模放大，需要更高且更一致的批次規(guī)模，生產(chǎn)需轉(zhuǎn)移至在搖擺式生物反應器或攪拌罐生物反應器中進行的懸浮培養(yǎng)，而培養(yǎng)基和添加物的選擇直接與生產(chǎn)細胞的擴增和活性以及下游工藝的成功有關(guān)，因培養(yǎng)基可影響載體的穩(wěn)定性并組成進入下游的進樣料液，需仔細優(yōu)化。

相比AV或AAV，LV下游工藝的更大挑戰(zhàn)在于其為囊膜病毒，固有的復雜性和敏感性需要快速的工藝處理，比如其對凍融循環(huán)、鹽、pH、剪切以及緩沖液滲透壓更為敏感，且顆粒熱穩(wěn)定性較低，37℃下半衰期為7-8 hr[7]。LV的下游工藝也可分為3個主要階段，包括收獲和澄清；中間體純化，其中包括1個或多個濃縮和純化步驟；精純、制劑以及選擇性進行的除菌過濾。

LV是細胞外產(chǎn)物，由生產(chǎn)細胞釋放到培養(yǎng)液中，所以，收獲液質(zhì)量高度取決于細胞活性，其決定了宿主細胞源性雜質(zhì)的含量。澄清旨在去除細胞和細胞碎片，深層過濾是該步驟一個簡單且經(jīng)濟的選擇，經(jīng)優(yōu)化后，可達到接近100%的收率。為提高最終產(chǎn)品的整體生物安全性，并符合法規(guī)標準，通常需要核酸酶處理，以消解核酸，這也有利于降低料液粘度，方便后續(xù)步驟操作，其通常在澄清步驟后進行，但也有報導在更為后續(xù)的階段體積進一步降低后進行。

層析是純化方案的關(guān)鍵技術(shù)，旨在去除蛋白質(zhì)、核酸、低分子量雜質(zhì)以及脂質(zhì)等，以結(jié)合-洗脫模式操作的陰離子交換層析和以流穿模式操作的復合模式層析已被報道單獨或結(jié)合用于LV的純化，但如前所述，由于LV對鹽和pH等條件敏感，需仔細優(yōu)化層析緩沖液條件。此外也有報道使用固定金屬親和層析和體積排阻層析，但通常限于較小的規(guī)模。TFF是快速且穩(wěn)健的料液濃縮和換液技術(shù)，對于LV，可選擇MWCO 750kD的中空纖維過濾器。藥物底物灌裝前的除菌過濾可使用0.22μm過濾器，但考慮LV較大的粒徑，報道該步驟損失可達到30-50%，一種降低損失的策略是在最終TFF步驟之前進行除菌過濾，或者使用封閉系統(tǒng)實現(xiàn)無菌工藝而跳過該步驟。